Darstellung der Acetylcholinesterase (ACE) nach Karnovsky und Roots
1. Kryostatschnitte, 15um dick, auf Polysine Objektträger, lufttrocknen. Die Schnitte können bei 4 °C im Kühlschrank in einer verschliessbaren Mappe/Box aufbewahrt werden.
2. Inkubation in Gebrauchsmedium bei 37°C im Wasserbad, 90 min., pro Biopsie zwei Objektträger inkubieren; einer ist für die Variante mit der Kernfärbung vorgesehen.
3. Spülen mit Aqua demin.
4. Für die Schnitte mit Gegenfärbung:
aufsteigende Alkoholreihe (70%, 96%, abs. Alk.), im zweiten abs. Alkohol 5 - 20 min. stehen lassen.
5. Die nicht gegenzufärbenden Schnitte:
6. Nach dem Aqua dem. Fixieren in phosphatgepuffertem Formol 4%, pH 7,0, 20 min.
7. Aqua dest. 2 x wechseln
8. Mit Medi-Mount2 (Medite 70-2100-30) überziehen und auf Heizplatte bei 60 – 70 °C trocknen. Schnitte in Xylol stellen und mit Pertex eindecken.
9. Gegenfärbung (ab Punkt 4): direkt aus dem Alkohol 1 min. Harris Hämatoxylin (Medite 41-1011-00), spülen und bläuen in handwarmem Wasser (kurz).
10. Auch die Gegengefärbten Schnitte ins Aqua dest. stellen und mit Medi-Mount überziehen und anschliessend decken, wie Punkt 7.
Herstellung von Gefriermedium
Acetylthiocholinjodid (Fluka 01480) | 500 mg |
Natriumacetat, wasserfrei, 0,06M, 5,14 g/725 ml (Merck 6268) jeweils in Aqua dest lösen |
725 ml |
Tri-Natriumcitrat-2-hydrat, 0,1M ,1,43g/50ml,(Merck 6430) | 50 ml |
Kupfersulfat x 5 H2O, 0,03M, (Merck 2790), 750 mg/100 ml | 100 ml |
Iso-Ompa (löst sich sehr langsam) | 25 ml |
(250 mg Iso-Ompa1 in 182 ml Aqua dest. vorlösen, im Kühlschrank lange haltbar).
Essigsäure konz. um den pH-Wert auf 5,5 – 5,6 einzustellen (ca. 7 Tropfen).
25 Portionen à 36 ml tiefgefrieren.
Substrat ist mehrere Monate bei –20°C haltbar.
Gebrauchslösung
Medium unter fliessendem warmem Wasser auftauen und auf ca. 37°C aufwärmen lassen.
4 ml Kaliumferrizyanid 0,005M, (Merck 4973),
(Stammlösung: z.B. 165 mg/100 ml Aqua dest., bei 4 °C aufbewahren, mehrere Monate haltbar)
1: Iso-Ompa: Tetraisopropylpyrophosphoramid, Sigma T 1505, 250 mg
2: Ohne Medi-Mount bleicht die Färbung innerhalb weniger Tage aus!