Lactat-Dehydrogenase (LDH) nach HESS et al.

1. Kryostatschnitte, 15um dick, auf Polysine Objektträger, lufttrocknen. Die Schnitte können bei 4°C im Kühlschrank in einer verschliessbaren Mappe/Box aufbewahrt werden.

2. Inkubation in Gebrauchsmedium LDH bei 37°C im Wasserbad, 5 - 15 min.

3. Spülen mit Aqua demin.

4. Fixieren in phosphatgepuffertem 4% Formalin, pH 7,0, 20 min.

5. Spülen in Leitungswasser

6. Aufsteigende Alkoholreihe, Xylol und mit Pertex eindecken.

Herstellung von Gefriermedium

Natrium-DL-lactat (Natrium-Lactat Fluka 71720) 1,0M, 11,2 g/300ml Dest. 300 ml
Natriumcyanid 0,1M (Merck 106437) 1g/200 ml, pH 7,2
Eingestellt mit 1N HCl
100 ml
Magnesiumchlorid Hexahydrat, 0,05M (2g/200 ml) 100 ml
PBS, (Phosphate Buffered Saline 0,01 - 0,025 molar) pH 7,4 250 ml
oder  Phospatpuffer (siehe Anhang)
Tetranitroblau-Tetrazoliumchlorid, 0,1%, wässerig
250 ml


(TNBT Fluka 87961. 250 mg TNBT in 5 ml Dimethylformamid vorlösen und tropfenweise unter Rühren zu 250 ml Aqua dest. geben.)
pH der Lösung auf 7,3 - 7,4 einstellen.

20 Portionen à 50 ml tiefgefrieren.
Substrat ist mehrere Monate bei -20°C haltbar.

Gebrauchslösung

Medium unter fließendem warmem Wasser auftauen und auf ca. 37°C aufwärmen lassen.
Co-Enzym NAD (b-Nicotinamide adenine dinucleotide Fluka 43410)
zugeben (100 +/- 10 mg, entspricht einem Volumen von 0,5 ml eines Eppendorf-Röhrchens), mischen und filtrieren.

Unbefriedigendes Ergebnis

pH kontrollieren! Evt. an einer Schnittreihe mit pH 7.0, 7,2, 7,4, 7,6 optimieren.
Eventuell 1 - 2 ml TNBT Lösung (250 mg TNBT in 20 ml Dimethylformamid) zusetzen.