Succinat-Dehydrogenase (SDH)
1. Kryostatschnitte, 15um dick, auf Polysine Objektträger, lufttrocknen. Die Schnitte können bei 4 °C im Kühlschrank in einer verschliessbaren Mappe/Box aufbewahrt werden.
2. Inkubation in Gebrauchsmedium SDH bei 37°C im Wasserbad, 15 min.
3. Spülen mit Aqua demin.
4. Fixieren in phosphatgepuffertem 4% Formalin, pH 7,0, 20 min.
5. Spülen in Leitungswasser
6. Aufsteigende Alkoholreihe, Xylol und mit Pertex eindecken.
Herstellung von Gefriermedium
| Natriumsuccinat (Fluka 14170), 0,2M | 13,5 g/250 ml |
| PBS, (Phosphate Buffered Saline 0,01 - 0,025 molar), pH 7,4 | 250 ml |
| oder Phospatpuffer (siehe Anhang) Tetranitroblau-Tetrazoliumchlorid, 0,1%, wässerig |
500ml |
(TNBT Fluka 87961. 500 mg TNBT in 10 ml Dimethylformamid vorlösen und tropfenweise unter Rühren zu 500 ml Aqua dest. geben.)
pH 7,4 - 7,6 mit Phosphatpuffer Stammlösung (NaH2PO4 x H2O, 13,89 g/l) einstellen.
20 Portionen à 50 ml tiefgefrieren.
Substrat ist mehrere Monate bei -20°C haltbar.
Gebrauchslösung
Medium unter fliessendem warmem Wasser auftauen und auf ca. 37°C aufwärmen lassen.
1 - 2 Kleinspatelspitzen b-Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Disodium salt (Fluka 43420) zugeben, mischen und filtrieren
Unbefriedigendes Ergebnis
pH kontrollieren! Evt. an einer Schnittreihe mit pH 7.0, 7,2, 7,4, 7,6 optimieren.
Eventuell 1 - 2 ml TNBT Lösung (250 mg TNBT in 20 ml Dimethylformamid) zusetzen.