Färbeprozedere Hirschsprung

(Verdichtetes Vorgehen/ alle Färbungen parallel)

1. Wasserbad (37°C) anschalten.

2. Co-Enzyme aus dem Kühlschrank nehmen.

3. Lösungen aus -25°C Kühlfach in fliessendem kaltem Wasser auftauen.

4. Tiefgekühlte Schnitte auf Zimmertemperatur bringen.

5. Küvetten, Zylinder und Trichter bereitstellen.

6. Parafo herstellen: 70 ml PBS und 10 ml Paraformaldehyd Stammlösung.

7. Delaunay frisch herstellen: 50 Abs. Alk. + 50 Aceton + 3 ml Trichloressigsäure.

8. Sirius-Schnitte für mind. 1 Std. ins Delaunay stellen.

9. NOS-Schnitte für 12 min. im Kühlschrank in Paraformaldehyd-Gebrauchslösung stellen.

10. Trichter mit Filterpapier in Kapelle richten.

11. Zu LDH Lösung NAD (Fluka 43410) geben, Deckel drauf geben, mischen und in Küvette filtrieren.

12. zu SDH Lösung 2 kl. Spatelspitzen NADH (Fluka 43420) geben, mischen und filtrieren.

13. zu NOS-Lösung 3 kl. Spatelspitzen NADH (Fluka 43420) geben, Deckel drauf, mischen und in Küvette filtrieren.

14. wenn Wecker von Parafo-Fixierungsschritt klingelt: 3 x mit PBS spülen.

15. zu ACE-Lösung: 4 ml Ferricyanidlösung geben, mischen, nicht filtrieren.

16. Nun alle Schnitte in die entsprechenden Farblösungen geben und die Küvetten ins Wasserbad stellen. Färbedauer: LDH, SDH und NOS 5 - 15 min. ACE 90 min.

17. Nach 5 - 15 min. LDH, SDH und NOS stoppen: 3 x mit Aqua demin. spülen, anschliessend 4 % Formalin und darin mind. 20 min. stehen lassen.

18. Später auch die ACE Färbung stoppen, spülen und mit Formalin fixieren.

19. Ausser ACE- Schnitte, die eine Kernfärbung erhalten sollen. Diese nach 1 x Aqua demin. mit 70%. 96%. abs, abs spülen. Im letzten Alkohol stehen lassen, mind. 20 min.

20. Sirius färben: 5 min. Celestinblau (filtriert) und 2 min. Harris Hämatoxylin (‚Hämalaun’) (filtriert).

21. Sirius-Schnitte nach Harris ca. 2 min. in kaltem Leitungswasser spülen und bläuen in lauwarmem Wasser.

22. Anschliessend mind. 1 h in Siriusrot Farblösung (unfiltriert) färben.

23. ACE-Schnitte nach Alkoholfixierung: direkt in Harris Hämatoxylin für ca. 1 min. Anschliessend  ca. 4 min. kaltes Leitungswasser zum spülen und bläuen in lauwarmem Wasser.

24. LDH, SDH, NOS Färbungen durch aufsteigende Alkoholreihe ziehen und mit Pertex eindecken.

25. ACE Schnitte mit und ohne Kernfärbung in Destwasser stellen und daraus mit Medi mount überziehen (ca. 4 Tropfen) auf Heizplatte (ca. 70°C) legen. Anschliessend in Xylol stellen und mit Pertex eindecken.

26. Sirius-Schnitte nach 1 h Siriusrot: 96, abs Alk., abs Alk., Xylol, mit Pertex decken.