Lactat-Dehydrogenase (LDH) nach HESS et al.
1. Kryostatschnitte, 15um dick, auf Polysine Objektträger, lufttrocknen. Die Schnitte können bei 4°C im Kühlschrank in einer verschliessbaren Mappe/Box aufbewahrt werden.
2. Inkubation in Gebrauchsmedium LDH bei 37°C im Wasserbad, 5 - 15 min.
3. Spülen mit Aqua demin.
4. Fixieren in phosphatgepuffertem 4% Formalin, pH 7,0, 20 min.
5. Spülen in Leitungswasser
6. Aufsteigende Alkoholreihe, Xylol und mit Pertex eindecken.
Herstellung von Gefriermedium
Natrium-DL-lactat (Natrium-Lactat Fluka 71720) 1,0M, 11,2 g/300ml Dest. | 300 ml |
Natriumcyanid 0,1M (Merck 106437) 1g/200 ml, pH 7,2 Eingestellt mit 1N HCl |
100 ml |
Magnesiumchlorid Hexahydrat, 0,05M (2g/200 ml) | 100 ml |
PBS, (Phosphate Buffered Saline 0,01 - 0,025 molar) pH 7,4 | 250 ml |
oder Phospatpuffer (siehe Anhang) Tetranitroblau-Tetrazoliumchlorid, 0,1%, wässerig |
250 ml |
(TNBT Fluka 87961. 250 mg TNBT in 5 ml Dimethylformamid vorlösen und tropfenweise unter Rühren zu 250 ml Aqua dest. geben.)
pH der Lösung auf 7,3 - 7,4 einstellen.
20 Portionen à 50 ml tiefgefrieren.
Substrat ist mehrere Monate bei -20°C haltbar.
Gebrauchslösung
Medium unter fließendem warmem Wasser auftauen und auf ca. 37°C aufwärmen lassen.
Co-Enzym NAD (b-Nicotinamide adenine dinucleotide Fluka 43410)
zugeben (100 +/- 10 mg, entspricht einem Volumen von 0,5 ml eines Eppendorf-Röhrchens), mischen und filtrieren.
Unbefriedigendes Ergebnis
pH kontrollieren! Evt. an einer Schnittreihe mit pH 7.0, 7,2, 7,4, 7,6 optimieren.
Eventuell 1 - 2 ml TNBT Lösung (250 mg TNBT in 20 ml Dimethylformamid) zusetzen.